Kjære Microbe

Share Tweet Pin it

Siden Pasteur er det kjent at den menneskelige mage-tarmkanalen i det vesentlige er en strømnings-type bioreaktor der mange mikroorganismer beboer. Vitenskapernes holdning til tarmmikrofloraen i løpet av denne tiden har endret seg radikalt. For hundre år siden, den store Ilya Mechnikov, grunnleggeren av den moderne teori om immunitet, for etablering av som han fikk Nobelprisen (for to personer med sin uforsonlige motstander, ikke mindre enn den store Paul Ehrlich), selv foreslått fjerning av tykktarmen som en måte å forlenge livet. Og til dem som dette tiltaket virket for radikalt, anbefalte jeg å drikke så mye kefir som mulig for å undertrykke skadelig, etter hans mening, mikrober med gunstige melkesyrebakterier. Etter et halvt århundre har kurset endret seg med 180 grader. Det viste seg at den normale intestinale mikrofloraen, så vel som huden og slimhinnene, utfører mange nyttige funksjoner - for eksempel undertrykker den vitaliteten av patogene mikroorganismer som stadig angriper kroppen. Og de siste årene har de mest modige mikrobiologene gått enda lenger, og deklarerer mennesket og hans mikrober som en enkelt symbiotisk superorganisme.

Utviklingen av molekylærbiologiske metoder brakte forskere til et nytt nivå for å forstå prosesser av symbiose av mennesket og hans mikroflora, som syntes å være godt studert og fra studien som ikke forventet noen spesielle overraskelser. Den raske veksten i fart og fallet i kostnaden for DNA-sekvenseringsmetoder (bestemmer dens nukleotidsekvens) og den parallelle økningen i kraften til personlige datamaskiner og utviklingen av Internett gjorde det mulig å analysere informasjon om store områder av genomet. Etter at kromosomene fra hundrevis av individuelle bakteriearter har blitt dechifrert, har en ny tilnærming kommet fram i mikroorganismenes genetikk - populasjonsmetoden: analyserer gener av alle bakterier som bor i et bestemt område samtidig. Selvfølgelig viste befolkningen i "human bioreactor" seg å være en av de viktigste for studiet av mikrobielle populasjoner.

Det første arbeidet, som førte til et nytt blikk på tarmmikrobiota, ble utgitt i 1999 av en gruppe forskere fra Nasjonalt institutt for jordbruksforskning (Frankrike) og Universitetet i Reading (Storbritannia). Forfatterne bestemte seg for å anvende metoden for sekvensering av 16S RNA-gener til studiet av tarmens mikrobielle populasjon.

16S RNA - bakterie ID

Siden Pasteur har det første og nødvendige trinnet i bestemmelsen av mikroorganismer vært deres dyrking på næringsmedier. Men mange viktige (og fordelaktige og patogene) mikrober vil ikke vokse i noe medium. Studier som tidligere var utilgjengelige uncultivable bakterier og begynner å rydde opp i ytterst forvirrende taksonomi av kjente prokaryoter ble mulig med utvikling av bioinformatikk og bruk av moderne molekylærbiologiske teknikker - polymerase kjedereaksjon (PCR), som tillater et enkelt stykke av DNA for å oppnå millioner og milliarder av nøyaktige kopier, klon isolert fra ved bruk av PCR-gener i bakterielle plasmider og sekvenseringsteknikker for nukleotidsekvenser oppnådd som et resultat av alt dette tilstrekkelig for ana Iza beløp.

En ideell markør for å identifisere mikroorganismer var genet som koder for 16S ribosomalt RNA (hver av de to underenhetene til ribosomcelleverksteder for proteinsyntese - består av sammenvunnet proteinmolekyler og kjeder av ribonukleinsyrer).

Dette genet er i genomet av alle kjente bakterier og arkea, men det er fraværende i eukaryoter og virus, og hvis du har funnet sin karakteristiske nukleotidsekvens, er du definitivt i ferd med å behandle gener av prokaryoter. (For å være veldig presis, eksisterer 16S RNA-genet også i eukaryoter, men ikke i nukleære kromosomer, men i mitokondriekromosomer. Dette bekrefter igjen at mitokondrier er fjerne etterkommere av symbiont-bakterier fra de første eukaryote organismer.)

Dette genet har begge konservative regioner, det samme for alle prokaryoter og artsspesifikke. Konservative steder tjener til den første etappen av polymerasekjedereaksjonen - ved å feste test-DNAet til primrene (frøseter av DNA som den studerte nukleotidkjeden må bli med for å begynne å analysere resten av sekvensen) og artsspesifikke - for å bestemme arten. I tillegg gjenspeiler graden av likhet av artespesifikke tomter det gode evolusjonære slektskapet til forskjellige arter.

En ekstra bonus er at for kloning og etterfølgende analyse kan du bruke ribosomal RNA selv, som er tilstede i en hvilken som helst celle i en mye større mengde enn det tilsvarende genet. Bare du må først "omskrive" det i DNA ved hjelp av en spesiell enzym-revers transkriptase.

16S RNA-nukleotidsekvensene av alle kjente bakterier og arkea (ca. 10.000 arter) er allment tilgjengelige. De identifiserte sekvensene er sammenlignet med de i databasene og nøyaktig identifiserer typen av bakterier eller erklærer den tilhørende de neste uoppdyrkede artene.

Nylig har det vært en intensiv revidering av den gamle fenotypiske klassifiseringen av bakterier basert på dårlig formaliserte kriterier - fra koloniens utseende til matpreferanser og muligheten til å bli farget med forskjellige farger. De nye systematikkene er basert på molekylære kriterier (16S RNA) og repeterer bare den fenotypiske delen.

De kodende sekvenser av 16S RNA ved PCR ble utvunnet direkte fra "miljø" - 125 milligram av humane, lei, avføring, ble satt inn i plasmid av E. coli (ikke fordi det tarm, og fordi Escherichia coli - ett av de favoritt hest molekylærbiologer ) og igjen isolert fra kulturen av forplantede bakterier. Dermed ble 16S RNA-genbiblioteket av alle mikroorganismer i prøven opprettet. Etter det ble 284 kloner tilfeldig valgt og sekvensert. Det viste seg at bare 24% av de oppnådde 16S RNA-sekvensene tilhørte tidligere kjente mikroorganismer. I mer enn hundre år har tre fjerdedeler av mikrofloraen i tarmene til hver person unngått oppmerksomheten til forskere som er bevæpnet med metodene for klassisk mikrobiologi! Forskere kunne rett og slett ikke finne betingelsene for dyrking av disse bakteriene, fordi de mest vilde innbyggerne i tarmen nektet å vokse på tradisjonelle mikrobiologiske medier.

I dag er det ved hjelp av molekylære metoder funnet at 10 av 70 store bakterielle taxa er representert i mikrobioten til en voksen. Omtrent 90% av de mikroorganismer hører til firmicutes type (dette inkluderer, for eksempel, den kjente lactobacilli - den viktigste "årsakene" surning melk) og bacteroidetes - obligate anaerobe (organismer som kan leve bare i fravær av oksygen), som ofte anvendes som en indikator på forurensning naturvann avløpsvann. De resterende 10% av befolkningen fordelt mellom taksa Proteobacteria (disse inkluderer, blant andre, E. coli), actinobakterier (fra en av de arter av Actinomycetes antibiotikum streptomycin ble isolert), Fusobacteria (vanlige innbyggere i munnhulen og ofte føre til periodontitt), verrucomicrobia spinosum (nylig i en geotermisk kilde ble funnet å være en art av disse mikrober som fôrer på metan, som er rikelig i tarmene på grunn av vitaliteten av andre mikroorganismer), Cyanobacteria (de kalles fremdeles ofte det gamle navnet "blågrønne alger"), Spirochaeates ( te, ikke blek), Synergistes og VadinBE97 (hva slags dyr er disse, spør skaperne av den nye prokaryotiske systematikken).

Til tross for at artssammensetningen av intestinale mikroorganismer er ganske monotont, kan det kvantitative forholdet mellom representanter for visse systematiske grupper i mikrobiotene av forskjellige mennesker variere sterkt. Men hva er den normale intestinale mikrofloraen og hvordan er dens formasjoner?

Dette spørsmålet ble besvart i et arbeid fra 2007 av en gruppe amerikanske biologer ledet av Patrick Brown fra Stanford University. De spores dannelsen av mikrobiota hos 14 nyfødte barn i løpet av det første år av livet. Forfatterne var i stand til å etablere flere kilder til kolonisering av mage-tarmkanalen. Mikrobiotaen av babyer hadde likheter med mors mikroflora: vaginal, fecal eller mikroflora av brystmelkprøver. Avhengig av kilder til kolonisering, fantes forskjellige arter i tarmmikroflora av spedbarn i løpet av det første år av livet. Disse forskjellene forblir signifikante gjennom hele studieperioden, men i en alder av ett år ble dannelsen av den voksne mikrobiota merkbar. Interessante data ble oppnådd på eksemplet av et par tvillinger. Mikrofloraen i dem var nesten identisk i sammensetningen og endret på samme måte. Dette funnet avslørte den enorme rollen som den humane komponenten av mikrobiota-vertparet i dannelsen av intestinalt mikroflora-populasjonen. For eksperimentets renhet ville det selvsagt være nødvendig å skille babyene mens de fortsatt var på sykehuset - en flott historie for en indisk film! Gjennom årene har de blitt kjent med hverandre ved analyse... Men data fra andre verk bekreftet antakelsen om at individet, inkludert arvelige egenskaper ved human biokjemi, har stor innflytelse på sammensetningen av mikrobiota.

Mikrobiell i oss mer enn menneske

I tillegg til å studere visse typer tarmmikroflora har mange forskere i de senere år studert bakteriell metagen - et sett med gener av alle mikroorganismer i en prøve av innholdet i tykktarmen (enten skyllet ut fra huden eller i en prøve av silt fra havbunnen). For dette formål er det mest automatisert, datastyrt og høy ytelse sekvensbestemmelse av DNA-teknologi, som gjør det mulig å analysere korte nukleotidsekvenser, samle puslespill flere samtidige "brev" i endene av disse partier, multippel gjenta denne prosedyren for hver del av genomet og motta dekoding av enkeltgener og kromosomer i en mengde opptil 14 millioner nukleotider per time - størrelsesordre raskere enn dette ble gjort for bare noen få år siden. Så ble det funnet at mikrobiotene i tykktarmen har ca. 100 billioner bakterieceller - omtrent 10 ganger mer enn det totale antall celler i verten. Settet av gener som utgjør det bakterielle metagenomet er omtrent 100 ganger større enn settet av gener av menneskekroppen. Hvis vi snakker om volumet av biokjemiske reaksjoner som finner sted inne i mikrobiell befolkning, er det igjen mange ganger høyere enn det i menneskekroppen. Den bakterielle "reaktoren" implementerer metabolske kjeder i vertsorganismen som den ikke kan støtte seg selv, for eksempel syntese av vitaminer og deres forløpere, dekomponering av visse toksiner, dekomponering av cellulose til fordøyelige polysakkarider (hos drøvtyggere), etc.

Studier utført i laboratoriet av Jeffrey Gordon (School of Medicine ved University of Washington, St. Louis, Missouri) tillatt å knytte arten mangfold av bakterier i mage-tarmkanalen med diett og metabolske egenskaper av den enkelte. Resultatene av forsøket ble publisert i desember 2006-utgaven av Nature. Énårsforsøket foreslo å etablere en sammenheng mellom overflødig vekt hos mennesker og sammensetningen av den mikrobielle befolkningen i tarmene. Et dusin fete mennesker som ble enige om å sette sine bellies på vitenskapsaltet, ble delt inn i to grupper. Man gikk på en fettfattig diett, den andre en lav-karbo diett. Alle frivillige mistet vekten, og samtidig forandret de forholdet mellom de to hovedgruppene av intestinale mikroorganismer: Antall Firmicutes-celler gikk ned, og antallet Bacteroidet tvert imot vokste. På et fettfattig kosthold ble en slik forandring merkbar senere - etter at pasientene mistet 6% av sin vekt og på lavt karboendiet - etter å ha mistet de første kiloene (2% av den opprinnelige kroppsvekten). I dette tilfellet var endringen i sammensetningen av mikrofloraen jo mer uttalt, jo mindre ble deltakerens vekt i eksperimentet.

Parallelt ble det i samme laboratorium utført eksperimenter på laboratoriemus som bærer en mutasjon i genet for leptin, "matningshormonet", et protein som syntetiseres i celler av fettvev og bidrar til dannelsen av en følelse av mykhet. Mus som har skadet begge kopiene av dette genet (denne mutasjonen er indikert av Lep ob-indeksen), spiser 70% mer enn villtype, med alle de følgende konsekvensene. Og innholdet av Firmicutes i tarmene er en og en halv ganger høyere enn den for heterozygote linjer, med bare en defekt allel (ob / +), og homozygot for det normale genet av vildtype linjer (+ / +).

Påvirkningen av mikroflora på metabolismen av sin "eier", forskerne sjekket på en annen modell - gnotobioticheskimi mus.

Slike dyr, som fra fødselstidspunktet lever i sterile kamre og aldri har møtt en enkelt mikrobe i deres liv, brukes ikke ofte i biomedisinsk forskning. Absolutt sterilitet i muskulaturen, kaninene og spesielt geiteskur - er dyrt og plagsom, og etter å ha møtt den første mikroben eller viruset, vil de dårlige skapninger enten dø eller bli uegnede til videre forsøk. Hva skjer i gnotobiotov med immunforsvaret er en egen historie, og de spiser for tre og samtidig - hud og bein på grunn av mangel på en mikrobiell komponent i fordøyelsen.

Etter transplantasjon av mikroflora fra obese (ob / ob) givere, ble gnatobiotmusen i to uker forsterket med nesten en og en halv ganger (47%). De som ble "seeded" med mikroflora fra vildtype (+ / +) donorer med normal vekt, gjenvunnet bare med 27%.

Resultatene av videre studier av endringer i den symbiotiske musemikrobielle organismen bekreftet briljant hypotesen om at mikrobiotene til overvektige individer bidrar til en dypere behandling av mat. Sammenligning av avføring DNA-prøver fra overvektige og normale mus har vist at fedme mikrobiomer er mettet med enzymgener som muliggjør mer effektiv nedbrytning av polysakkarider. Tarmene av fete mus inneholdt store mengder sluttprodukter av gjæring - forbindelser av eddiksyre og smørsyre, noe som indikerer en dypere behandling av matkomponenter. Kalorimetrisk (fra ordet "kalorier"!) Analyse av avføringprøver bekreftet dette: avføring av ob / ob-mus inneholdt færre kalorier enn villtype mus, som ikke fullt absorberte energi fra mat.

I tillegg til viktig informasjon om "spire" komponent av fedme, forfatterne var i stand til å vise den grunnleggende likhet mellom mikroflora av overvektige mennesker og mus, som åpner nye perspektiver i studiet av problemet med overvekt, og kanskje - og for å løse dette problemet ved å "overføre" sunn mikroflora eller dens dannelse hos pasienter vektige.

Det faktum at mikrobioten kan kontrollere vertenes metabolisme er ikke lenger i tvil. Gordons forskning på overflødig vekt har gitt en bro til behandling av metabolske sykdommer, for eksempel generell utmattelse som påvirker barn fra ett til fire år i fattige land med et tropisk klima - marasmus (dette ordet har bare et språklig forhold til marasmus: gresk marasmos bokstavelig talt betyr utmattelse, utryddelse) og kwashiorkor (på språket til en av stammene i Ghana, kwashiorkor - "rød gutt"). Fremveksten av sykdommer er forbundet med mangel på proteiner og vitaminer under overgangen fra amming til voksen mat. Men sykdommen selektivt påvirker barn hvis brødre og søstre ikke opplevde noen problemer med overgangen til det tradisjonelle dietten for regionen. Studier har vist at den tarmmikroflora av syke barn er svært forskjellig fra foreldrenes mikroflora, samt fra mikrofloraen til friske brødre og søstre. Først og fremst ble det observert det nesten fullstendige fraværet i tarmpopulasjonen av bakteroidetene og dominansen av sjeldne arter som tilhører typene Proteobacteria og Fusobacteria. Etter syke barn (nøye, for ikke å overdose!) Ble matet intensivt protein mat, ble deres mikrobiota lik normal, for eksempel i slektninger, med en overvekt av Bacteroidetes og Firmicutes.

Nylige studier har ikke bare fundamentalt endret den nåværende forståelsen av den menneskelige intestinale mikrofloraen, men bidro også til fremveksten av et konsept som betrakter tarmmikrobiota som et ekstra multicellulært "organ" av menneskekroppen. Et organ bestående av forskjellige cellelinjer som er i stand til å kommunisere både mellom seg selv og med vertsorganismen. Kroppen som omfordeler energistrømmer, utfører viktige fysiologiske reaksjoner, endringer som påvirkes av miljøet og selvregenererer når forandringer er forårsaket av ytre forhold.

Fortsatt forskning "bakteriell kroppen" kan og bør føre til en forståelse av lovene i sitt virke, avsløringen av hans delikate relasjoner med verten, og som en konsekvens, fremveksten av nye metoder for å bekjempe menneskelige sykdommer ved målrettet behandling av dysfunksjoner både metaorganizma komponenter.

Valery Poroiko, Ph.D.
University of Chicago, Institutt for generell kirurgi
Portal "Evig ungdom" www.vechnayamolodost.ru

Journal versjon av artikkelen publisert i Popular Mechanics No. 4-2008

Arteridentifikasjon av bakterier ved sekvensering av 16S genet av ribosomalt RNA, rolle og sted for metoden ved diagnostisering av bakterielle infeksjoner. Fullført: Saveliev. - presentasjon

Presentasjonen ble publisert for 4 år siden av Ludmila Shumikhina

Beslektede presentasjoner

Presentasjon av 11. klasse om emnet: "Arter identifikasjon av bakterier ved å sekvensere 16S genet av ribosomalt RNA, rolle og sted for metoden ved diagnose av bakterielle infeksjoner. Fullført: Saveliev.". Last ned gratis og uten registrering. - Transkripsjon:

1 Arteridentifikasjon av bakterier ved sekvensering av 16S genet av ribosomalt RNA, rolle og sted for metoden ved diagnostisering av bakterielle infeksjoner : Cand. Biol. Afonyushkin Vasily Nikolaevich PhD Biol. Afonyushkin Vasiliy Nikolaevich

2 Formål: 1. For å mestre DNA elektroforese i en agarosegel 2. For å lære metoden for analyse av sekvenseringsresultater, og utfører bygging av nukleotidsekvenser, genfragmenter 16 S ribosomal RNA fra isolater oppnådd hoved slekten Bacillus 1. DNA elektroforese i en agarosegel 2. For å lære metoden for å analysere sekvenseringsresultatene og utføre konstruksjonen av nukleotidsekvenser av fragmenter av 16 S-genet fra ribosomal RNA av de oppnådde isolatene av slekten Bacillus 3. Undersøk utsiktene for felles bruk av sekvenseringsmetoder og biokjemi cal identifisering av bakterier 3. For å studere mulighetene for å dele-sekvenseringsmetoder, og biokjemisk identifisering av bakterier Mål: For å studere mulighetene for metoden for spesifikk identifisering av bakterier ved sekvensering av 16S ribosomalt RNA i forbindelse med tradisjonelle metoder for identifisering

3 materialer og metoder Pure kulturer av isolater ble sådd på MPA, og etter timer inkubering ble bakteriell suspensjon fremstilt på fosfat-saltvannbuffer. Kulturer ble farget av Gram og mikroskopisk. Bedømt efter biokjemiske egenskaper: Deponering sitrat, malonat, glukose, laktose, mannitol, sukrose, inositol, sorbitol, arabinose, maltose, fenylalanin, dannelsen av indol, hydrogensulfid, atsetilmetilkarabinola (reaksjons Foges- Proskauer), nærværet av beta-galaktosidase, urease, arginin-decarboxylase og lysin, argininhydrolase. Kulturer ble testet for katalase-, cytokromoksidase-aktiviteter, dannelsen av nitritt, pigmentens syntese, antibiotikaresistens, studerte kulturelle og morfologiske egenskaper. Beta-galaktosidase, og tritofandezaminaznuyu glyukoronidaznuyu aktivitet ble testet på medium Uriselekt 4 (BioRad) DNA ble isolert ved fenolhloroformennym vis bestemt basert på sekvensering av 16S ribosomal gen av RNAi-fragment av den intergeniske spacer med ribosomalt RNA og 16-23S flerhet biokjemiske, kulturelle og morfologiske egenskaper.

4 Kulturelle egenskaper: de dyrkede kulturene vokste ikke på Endo-mediet, dvs. omhandlet ikke enterobakterier, dyrket på en kjøtt-pepton-agar under aerobe betingelser ved 37 ° C tinctorial egenskaper: kultur som er dyrket undersøkt mikroskopisk og Gram-farging som tillater å fastslå at den oppnådde kultur er spore Gy + pinner Kjennetegn kulturer

5 Studieutforming: DNA ble isolert fra dyrkede kulturer og PCR ble satt opp med universelle primere, som et resultat forsterket vi et fragment av 16S-genet av ribosomalt RNA

6 En oppløsning med en primer er fordelt i 4 reagensrør, som hver inneholder 4 deoksynukleotider dATP, dTid, dTPP (en av dem er merket med en radioaktiv isotop) og en av fire 2; Den aktiveres i alle posisjoner i den voksende kjedeblandingen, og etter vedlegget stopper kjedevæxten umiddelbart. Som et resultat dannes i hvert av de fire rørene med deltagelse av DNA-polymerase et unikt sett med oligonukleotider av forskjellige lengder, inkludert primer-sekvensen. Deretter tilsettes formalid til rørene for divergens av kjedene og polyakrylatgelelektroforese utføres på fire baner. Radioautografi utføres, som lar deg "lese" nukleinsekvensen av DNA-segmentet som skal sekvenseres. I biokjemi og molekylærbiologi brukes elektroforese til å separere proteinmakromolekyler og nukleinsyrer (samt deres fragmenter). Det er mange varianter av denne metoden. Denne metode finner bred anvendelse for separasjon av blandinger av biomolekyler i fraksjoner eller enkeltstoffer og benyttes i biokjemi, molekylær biologi, Clinical Diagnostics, populasjonsbiologi (for å studere genetisk variasjon) og dr.belkovnukleinovyh syrer Elektroforese denne elektrokinetisk fenomen forskyvning av den dispergerte fase (kolloid eller protein løsninger) i et flytende eller gassformet medium under virkningen av et eksternt elektrisk felt. Elektrokinetisk fenomen av det elektriske felt Elektroforese Studiestruktur: PCR-produkter ble separert med agarosegelelektroforese. Sanger Metode

7 Resultater av egen forskning Fig. 1 Resultater av kapillærelektroforese av et fragment av 16 S-genet av ribosomalt RNA

8 Figur 2 fylogenetisk tre konstruert på grunnlag av resultatene av justering av et fragment av 16S genet av ribosomalt RNA

9 Resultater av egen forskning Pic. 3 resultater av nukleotidsekvens sammenligning

10 Resultater av biokjemiske studier kulturer ved å bruke test PBDE Biokjemiske egenskaper av stammen B. licheniformis: negativ utnyttelse citrat, malonat negativ, natriumcitrat + glukose negativ negativ lysin, arginin negativ, negativ ornitin, fenylalanin negativ, indol negativ, urease positiv atsetilmetilkarabinol negativt sulfid negativ, glukose positiv, b-galaktosidase positiv, laktos negativ, vinker positiv, sukrose positiv, inositol positiv oh, sorbitol er positiv, maltose er positiv

11 Konklusjon Spesifikke identifisering av mikroorganismer basert på sekvensering kan være "gullstandarden" for laboratoriediagnostikk, men nøyaktigheten av metoden er begrenset av nøyaktigheten og fullstendigheten til GenBank-databasene og krever derfor ytterligere bruk av bekreftende tester.

16-årig analyse

Bioteknologi, 2005, nr. 6, s. 3-11

En metode for identifisering av mikroorganismer basert på analysen av lengdepolymorfismen av restriksjonsfragmenter (PDFR) av et PCR-produkt av 16S RNA-genet med en lengde på 1500 nukleotider er foreslått. Et sett med 6 restriksjonsendonukleaser (Sse9I, Tru9I, BsuRI, MspI, BstMBI og RsaI) ble valgt, hvilket muliggjør identifisering av et bredt spekter av mikroorganismer ved bruk av PCGF.
Fire isolater av termolabel alkalisk fosfatase ble isolert fra naturlige isolater av sjøvann. Analysen av PDFR for disse stammene i sammenligning med de beregnede resultater oppnådd for 16S RNA-gener av forskjellige mikroorganismer, gjorde det mulig å fastslå at de identifiserte produsentene tilhører slekten Alteromonas.

Sammen med tradisjonelle metoder for å identifisere mikroorganismer som bruker kulturelle og morfologiske egenskaper, samt kjemiske og biokjemiske reaksjoner [1], metoder for å bestemme mikroorganismer basert på sammenligning av nukleotidsekvenser av forskjellige mikroorganismer [2-4] og analyse av polymorfien av lengder av DNA-restriksjonsfragmenter oppnådd som et resultat av amplifikasjonen av individuelle bakteriegener [5, 6]. Generene som koder for 16S og 23S ribosomalt RNA er de mest egnede for identifikasjon, siden de er til stede i alle bakterielle celler og er slektspesifikke for de fleste mikroorganismer [7-9]. Bruken av et DNA-fragment som inneholder både 16S- og 23S-RNA-gener og mellomromet mellom dem, som er mer variabelt, kan brukes til å identifisere nært beslektede arter og underarter av mikroorganismer [10].

Dette dokumentet viser resultatene av RFLP-analyse av PCR-produktet 1500 nukleotider i lengde for forskjellige mikroorganismer og vist at bruk av restriksjonsendonuklease 6 Sse9I, Tru9I, BsuRI, Mspl, BstMBI Rsal og kan på en pålitelig måte å identifisere de fleste mikroorganismer. I dette arbeidet ble 4 nye produsenter av termolabile alkaliske fosfataser identifisert, og ved bruk av den foreslåtte metoden ble en komparativ analyse av PDPR utført for å identifisere disse mikroorganismer. Basert på sammenligningen ble det konkludert med at de funnet produsentene tilhører slekten Alteromonas.

EKSPERIMENTVILKÅR

For å identifisere produsentene av termolabile alkaliske fosfatase, ble 50 ul sjøvann malt på næringsmiddel-agaroverflaten og analysert som beskrevet i [11]. Produksjonen av mikroorganismens biomasse ble utført ved å dyrke produsentene ved 20 ° C i en buljong inneholdende 1% trypton (AGS GmbH, Tyskland), 0,5% gjærekstrakt (samme selskap) og saltvann (NaCl - 27,5, MgCl2 - 5, MgSO4 - 2, CaCl2 - 0,5, KCl - 1, FeSO4 - 0,001 g / l [12]), pH 7,2 - 7,7. Den podede buljongen ble fordelt i 200 ml i 700 ml gnistkolber og ristet ved 150 rpm i 16 timer.

Isolering av kromosomalt DNA ble utført i henhold til metoden til [13].

Amplifisering av 16S-genet av ribosomalt RNA ble utført under anvendelse av en polymerasekjedereaksjon som beskrevet i [14].

Restriksjonsreaksjonen av det amplifiserte DNA ble utført i 4 timer ved 37 ° C i 20 ul av reaksjonsblandingen inneholdende 2 enheter. handling. restrictase Sse9I, Tru9I, BsuRI, MspI, BstMBI eller RsaI produsert av NPO SibEnzyme, i den tilsvarende buffer. Reaksjonen ble stoppet ved å tilsette 5 ul av en stoppløsning inneholdende 0,1 M EDTA, 0,05% bromfenolblått og 40% sukrose.

Elektroforetisk separasjon av produktene fra det restriksjonsforsterkede DNA ble utført i 2% agarose (Sigma) i tris-acetatbuffer med etidiumbromid (0,5 mg / l) ved 120 V i 4 timer.

For å bestemme lengden av DNA-fragmenter ble DNA molekylvektmarkører brukt (100bp +1,5 Kb DNA markører, NPO SibEnzyme). Bestemmelsen av lengdene av de oppnådde begrensninger ble gjennomført ved bruk av dataprogrammet Gel Pro Analyzer, versjon 4.0.00.001. Prosentidentiteten av fragmentlengder ble beregnet for hvert par av mikroorganismer, sammenligning av restriksjonsmønstre separat for hvert restriksjonsenzym. Ved sammenligning av restriksjonslengder ble DNA-fragmenter ansett som identiske, hvis lengde var forskjellig med ikke mer enn 5%.

For å sammenligne eksperimentelle data med de publiserte 16S RNA-gensekvensene ble en genetisk databank av de sekventerte sekvensene brukt.

RESULTATER OG DISKUSSJON

Fra naturlige isolater av sjøvann isolerte vi fire stammer-produsent av termolabile fosfatase, betegnet 20, 27, 48 og stammen beskrevet tidligere [11] ved bruk av tradisjonelle metoder som Alteromonas undina. For å identifisere stammer oppnådd fra biomassen av mikroorganismer dyrket i et flytende næringsmedium med tilsetning av sjøsalter ble kromosomalt DNA isolert.
Deretter ble kromosomalt DNA anvendt i polymerasekjedereaksjonen for å amplifisere 16S-genet av ribosomalt RNA. Amplifikasjonsproduktet ble uavhengig behandlet med 6 forskjellige restriksjonsendonukleaser. Alle restriksjonene som brukes av oss har et tetranukleotidgenkjenningssete, som gjør det mulig å oppnå fra 3 til 8 DNA-fragmenter som et resultat av spaltning av amplifikasjonsproduktet, som er ca. 1500 nukleotider i lengde. De anvendte Sse9I- og Tru9I-restriksjonsenzymer har henholdsvis AATT- og TTAA-anerkjennelsessites, mens BsuRI- og MspI-restriksjonsenzymer skjæres gjennom GGCC- og CCGG-stedene. Restriksjonssidene BstMBI og RsaI, henholdsvis GATC og GTAC, inneholder alle fire nukleotider. Et slikt utvalg av restriktionsendonukleaser, etter vår mening, skal gi universalitet i identifisering av mikroorganismer med både AT-rike og GC-rike genomer. Kvantitativt, bruk av bare seks forskjellige restriksjons vi tro optimalt, siden bruken av restriksjonsendonukleaser 1 eller 3, som foreslått i flere studier [10,15] kan ikke påvise polymorfisme for identifikasjon av nært beslektede organismer eller alternativt føre til for store forskjeller iz for en eller flere tilfeldige mutasjoner. Samtidig fører bruken av 10 forskjellige restriksjonsendonukleaser ikke til ytterligere deteksjon av DNA-restriktionsfragmentets lengdepolymorfisme og er klart overdreven [9].
Figur 1 viser datasimulerte mønstre av begrensningen av 16S gener for RNA, et sett med seks restriksjons enzymer foreslått av oss (Sse9I, Tru9I, BsuRI, MspI, BstMBI og RsaI). 16S-RNA-gener er tatt fra den genetiske banken til de sekventerte sekvensene. Valget av mikroorganismer var ganske tilfeldig. Alle bakterier tilhører forskjellige slanger og representerer både gram-negative og gram-positive mikroorganismer. Det er sett at for alle mikroorganismer har sitt eget unike mønster av et sett av restriksjoner. Antallet DNA-fragmenter varierer fra 23 til 30 (fragmenter med lengde mindre enn 100 basepar er ikke tatt i betraktning). Resultatene av beregning av prosentidentiteten av lengdene av DNA-fragmenter (begrensninger anses å være identiske, er ikke mer enn 5% forskjellige) for forskjellige par av mikroorganismer er presentert i tabell 1. Denne tabellen viser bare en brøkdel av de mulige par av mikroorganismer vist i fig. 1. Men de presenterte sammenligningsresultater er ganske karakteristiske og tillater oss å se at prosentvis identitet av lengdene av DNA-fragmenter vanligvis varierer fra 12-28% for representanter for forskjellige genera av mikroorganismer. Dermed viser de presenterte dataene at restriksjonsmønsteret av 16S RNA-gener med settet av restriksjonsenzymer som tilbys av oss, kan tjene som grunnlag for å identifisere slekten av bakterielle celler.

Fig. 1. Teoretisk beregnet mønster av elektroforetisk separasjon av 16S RNA genet amplifiseringsprodukter etter behandling med restriksjonsenzymene Sse9I (1), Tru9I (2), BsuRI (3), Mspl (4), BstMBI (5) og Rsal (6). Spor M - molekylvektmarkør

Verdien av 16S RNA i systematikk. Molekylær hybridisering av 16S RNA.

Molekylær hybridisering av 16S rRNA. Prokaryotisk ribosom består av 3 underenheter, store (23S), (5S) og (16S). Gene 16S rRNA har følgende egenskaper viktige i fylogeni:

1. RNA ribosomer er universelle for forskjellige arter, som selve ribosomene. 2. 16S rRNA molekylet er konservativt og minst utsatt for endringer i løpet av den biologiske evolusjonen. Endringshastigheten for 16S rRNA-genet i forskjellige symbiotiske bakterier var 2-4% av nukleotid-substitusjoner over 60 Myr.3. 16S rRNA-genet har både ultrakonserverte og variable regioner (domener), som gjør det mulig å evaluere fjernt og nært slektskapsforhold.4. I tillegg ble det funnet at rRNA cistrons ikke er involvert i interspesifikke genetiske overføringsprosesser.5. Størrelsen på genet (i prokaryoter, det er ca. 1550-1640 bp i lengde) er optimal fra synspunktet om å redusere statistiske feil. En komplett sekvens kan bestemmes i en sekvensering ved bruk av Sanger-metoden. Sammenligning av nukleotidkataloger. Metoden ble brukt tidlig på 80-tallet og hadde stor historisk betydning i systematikken til bakterier. Samtidig ble RNA-molekylet (16S rRNA) behandlet med ribonuklease T, som spalt molekylet i guaninrester. Størrelsen på de oppnådde fragmenter var ikke mer enn 20 nukleotider. De resulterende oligonukleotider ble separert ved 2-dimensjonal elektroforese, sekvensert og samlet en katalog som spesifikt kjennetegner rRNA-molekylet. Ved sammenligning av kataloger ble det tatt hensyn til fragmenter med en lengde på minst 6 nukleotider. Ved å anvende likhetskoeffisientene mellom katalogene ble det først konstruert et vanlig fylogenetisk tre for prokaryoter. Riboprinting. Metoden er basert på restriksjonsanalysen av rRNA-gener. For dette isoleres totalt DNA fra cellen. To primere som er homologe til de høyt konserverte flankerende områdene av 16S rRNA (små underenhetens rDNA) -gen, blir tatt og PCR utføres. Fragmentene behandles med flere restriksjonsendonukleaser, og restriksjonsproduktene for hver av endonukleasene separeres på en agarosegel sammen med profilen til størrelsesstandard-DNA. Fragmentlengdepolymorfisme oppstår på grunn av det faktum at en del av restriksjonssidene faller inn i konservative domener i genet, og noen - til variable domener. I denne delen av fragmentene vil det være felles for alle arter i prøven. Ved antall vanlige og forskjellige fragmenter er det mulig å beregne den genetiske avstanden mellom arter. Bruken av 12 restriktjonsenzymer med anerkjennelsessteder med 4 nukleotider i lengde gjør det mulig å dekke 10-15% av lengden av 16S rRNA-genet ved analyse uten sekvensering.

Kjære Microbe

Valery Poroiko,
Ph.D., University of Chicago, Institutt for generell kirurgi
Populær mekanikk ı4, 2008

For hundre år siden ble mikrober som levde i tarmene, ansett som parasitter og skadedyr. I de senere år har den menneskelige mikrobioten blitt kalt en slags organ i kroppen vår, som er nødvendig for kroppens normale funksjon.

Siden Pasteur er det kjent at den menneskelige mage-tarmkanalen i det vesentlige er en strømnings-type bioreaktor, hvor mange mikroorganismer beboer. Vitenskapernes holdning til tarmmikrofloraen i løpet av denne tiden har endret seg radikalt. For hundre år siden, den store Ilya Mechnikov, grunnleggeren av den moderne teori om immunitet, for etablering av som han fikk Nobelprisen (for to personer med sin uforsonlige motstander, ikke mindre enn den store Paul Ehrlich), selv foreslått fjerning av tykktarmen som en måte å forlenge livet. Og til dem som dette tiltaket virket for radikalt, anbefalte jeg å drikke så mye kefir som mulig for å undertrykke skadelig, etter hans mening, mikrober med gunstige melkesyrebakterier. Etter et halvt århundre har kurset endret seg med 180 grader. Det viste seg at den normale intestinale mikrofloraen, så vel som huden og slimhinnene, utfører mange nyttige funksjoner - for eksempel undertrykker den vitaliteten av patogene mikroorganismer som stadig angriper kroppen. Og de siste årene har de mest modige mikrobiologene gått enda lenger, og deklarerer mennesket og hans mikrober som en enkelt symbiotisk superorganisme.

Utviklingen av molekylærbiologimetoder førte forskere til et nytt forståelsesnivå for prosesser av symbiose av mennesket og hans mikroflora, som virket godt studert og ikke forventet noen spesielle overraskelser fra videre studier. Den raske veksten i fart og fallet i kostnaden for DNA-sekvenseringsmetoder (bestemmer dens nukleotidsekvens) og den parallelle økningen i kraften til personlige datamaskiner og utviklingen av Internett gjorde det mulig å analysere informasjon om store genomregioner. Etter at kromosomene fra hundrevis av individuelle bakteriearter har blitt dechifrert, har en ny tilnærming kommet fram i mikroorganismernes genetikk - populasjonsbasert: analyserer gener av alle bakterier i et bestemt område samtidig. Selvfølgelig viste befolkningen i "human bioreactor" seg å være en av de viktigste for studiet av mikrobielle populasjoner.

Det første arbeidet, som førte til et helt nytt utseende på tarmmikrobiota, ble utgitt i 1999 av en gruppe forskere fra Nasjonalt institutt for jordbruksforskning (Frankrike) og Universitetet i Reading (Storbritannia). Forfatterne bestemte seg for å anvende metoden for sekvensering av 16S RNA-gener til studien av tarmens mikrobielle populasjon (se sidebjelken).

16S PHK - Bacter ID

Det første trinnet i bestemmelsen av mikroorganismer er deres dyrking på næringsmedier. Men en rekke mikrober vil ikke vokse i noe medium.

Moderne teknikker
Studier som tidligere var utilgjengelige ikke-dyrkbare bakterier og begynner å innføre orden i ytterst forvirrende taksonomi allerede kjent prokaryot ble mulig med utvikling av bioinformatikk og ankomsten av moderne teknikker for molekylær biologi - PCR tillater en DNA-region for å motta milliarder av kopier, klone det utvalgte genet i bakterielle plasmider og sekvensering sekvenser metodikk nukleotider oppnådd i tilstrekkelig mengde til analyse. En ideell markør for å identifisere mikroorganismer var genet som koder for 16S ribosomalt RNA (hver av de to underenhetene til ribosomcelleverksteder for proteinsyntese - består av sammenvunnet proteinmolekyler og kjeder av ribonukleinsyrer).

Perfekt markør
Dette genet er i genomet av alle kjente bakterier og arkea, men det er fraværende i eukaryoter og virus, og hvis du har funnet sin karakteristiske nukleotidsekvens, er du definitivt i ferd med å behandle gener av prokaryoter. Dette genet har begge konservative regioner, det samme for alle prokaryoter og artsspesifikke. Konservative steder tjener til den første etappen av polymerasekjedereaksjonen - ved å feste test-DNAet til primrene (frøseter av DNA som den studerte nukleotidkjeden må bli med for å begynne å analysere resten av sekvensen) og artsspesifikke - for å bestemme arten. Graden av likhet av artsspesifikke tomter gjenspeiler evolusjonær slektskap for forskjellige arter. For kloning og etterfølgende analyse kan du bruke ribosomal RNA selv, som er tilstede i en hvilken som helst celle i større mengde enn det tilsvarende genet. 16S RNA-nukleotidsekvensene av alle kjente bakterier og arkea er allment tilgjengelige. De identifiserte sekvensene er sammenlignet med de i databasene og identifiserer typen av bakterier eller erklærer den tilhørende de uoppdyrkede artene.

Ny taksonomi
Nylig har det vært en intensiv revidering av den gamle fenotypiske klassifiseringen av bakterier basert på dårlig formaliserte kriterier - fra koloniens utseende til matpreferanser og muligheten til å bli farget med forskjellige farger. De nye systematikkene er basert på molekylære kriterier (16S RNA) og repeterer bare den fenotypiske delen.

Hva vi har inni

De kodende sekvenser av 16S RNA ved polymerasekjedereaksjon (PCR) ble trukket direkte fra "miljø" - 125 mg humant, lei, avføring ble satt inn i plasmid av E. coli (ikke fordi det tarm, og fordi Escherichia coli - en Fave arbeidshestene til molekylære biologer) og ble igjen isolert fra en kultur av forplantede bakterier. Dermed ble 16S RNA-genbiblioteket av alle mikroorganismer i prøven opprettet. Etter det ble 284 kloner tilfeldig valgt og sekvensert. Det viste seg at bare 24% av de oppnådde 16S RNA-sekvensene tilhørte tidligere kjente mikroorganismer. I mer enn hundre år har tre fjerdedeler av mikrofloraen i tarmene til hver person unngått oppmerksomheten til forskere som er bevæpnet med metodene for klassisk mikrobiologi! Forskere kunne rett og slett ikke finne betingelsene for dyrking av disse bakteriene, fordi de mest vilde innbyggerne i tarmen nektet å vokse på tradisjonelle mikrobiologiske medier.

I dag er det ved hjelp av molekylære metoder funnet at 10 av 70 store bakterielle taxa er representert i mikrobioten til en voksen. Omtrent 90% av de mikroorganismer hører til firmicutes type (dette inkluderer, for eksempel, den kjente lactobacilli - den viktigste "årsakene" surning melk) og bacteroidetes - obligate anaerobe (organismer som kan leve bare i fravær av oksygen), som ofte anvendes som en indikator på forurensning naturvann avløpsvann. De resterende 10% av befolkningen fordelt mellom taksa Proteobacteria (disse inkluderer, blant andre, E. coli), actinobakterier (fra en av de arter av Actinomycetes antibiotikum streptomycin ble isolert), Fusobacteria (vanlige innbyggere i munnhulen og ofte føre til periodontitt), verrucomicrobia spinosum (nylig i geotermisk kilde ble oppdaget form av mikrober som lever av metan, som abound i tarmen på grunn av andre mikroorganismer), cyanobakterier (de er likevel ofte referert til som den gamle - "en blå-grønn alge»), spiroketer (heldigvis nd, ikke blek), Synergistes og VadinBE97 (hva slags dyr, spør skaperne av den nye taksonomi av prokaryoter).

Mikrobiell i oss mer enn menneske

For dette formål er det mest automatisert, datastyrt og høy ytelse DNA-sekvenseringsteknologi, noe som gir en mulighet til å analysere den korte nukleotidsekvens, montere puslespillet av flere overlappende "brev" ved endene av disse områdene gjentatte ganger å gjenta denne prosedyren for hver del av genomet, og for å motta utskrifter av enkeltgener og kromosomer med i hastigheter på opptil 14 millioner nukleotider i timen - størrelsesordener raskere enn de gjorde for noen få år siden. Så ble det funnet at tarmmikrobiota har ca. 100 billioner bakterieceller - omtrent ti ganger mer enn det totale antall celler i menneskekroppen.

Settet av gener som utgjør det bakterielle metagenomet er omtrent hundre ganger større enn settet av gener av menneskekroppen. Hvis vi snakker om volumet av biokjemiske reaksjoner som foregår i mikrobiell befolkning, er det igjen mange ganger høyere enn volumet av biokjemiske reaksjoner i menneskekroppen.

Den bakterielle "reaktoren" implementerer metabolske kjeder i vertsorganismen som den ikke kan støtte seg selv, for eksempel syntese av vitaminer og deres forløpere, dekomponering av visse toksiner, dekomponering av cellulose til fordøyelige polysakkarider (hos drøvtyggere), etc.

Fra barndom til alderdom

Til tross for at artssammensetningen av intestinale mikroorganismer er ganske monotont, kan det kvantitative forholdet mellom representanter for visse systematiske grupper i mikrobiotene av forskjellige mennesker variere sterkt. Men hva er den normale intestinale mikrofloraen og hvordan er dens formasjoner?

Dette spørsmålet ble besvart i et arbeid fra 2007 av en gruppe amerikanske biologer ledet av Patrick Brown fra Stanford University. De spores dannelsen av mikrobiota hos 14 nyfødte barn i løpet av det første år av livet. Forfatterne var i stand til å etablere flere kilder til kolonisering av mage-tarmkanalen. Mikrobiotaen av babyer hadde likheter med mors mikroflora: vaginal, fecal eller mikroflora av brystmelkprøver. Avhengig av kilder til kolonisering, fantes forskjellige arter i tarmmikroflora av spedbarn i løpet av det første år av livet. Disse forskjellene forblir signifikante gjennom hele studieperioden, men i en alder av ett år ble dannelsen av den voksne mikrobiota merkbar. Interessante data ble oppnådd på eksemplet av et par tvillinger. Mikrofloraen i dem var nesten identisk i sammensetningen og endret på samme måte. Dette funnet avslørte den enorme rollen som den menneskelige komponenten av mikrobiota-vertparet i dannelsen av den intestinale mikroflorapopulasjonen. For eksperimentets renhet, selvfølgelig, ville det være nødvendig å skille babyene mens de fortsatt var på sykehuset (forresten, en fantastisk historie for en indisk film! I løpet av årene lærer tvillingene seg om hverandre fra mikrofloraanalyser.). Men data fra andre studier bekreftet antagelsen om at individet, inkludert arvelige egenskaper i human biokjemi, har stor innflytelse på sammensetningen av mikrobiota.

Tynn og tykk

Studier utført i laboratoriet av Jeffrey Gordon (School of Medicine ved University of Washington, St. Louis, Missouri), tillatt å knytte arten mangfoldet av bakterier i mage-tarmkanalen med diett og metabolske egenskaper av den enkelte. Resultatene av forsøket ble publisert i desember 2006 av Nature magazine. Énårsforsøket foreslo å etablere en sammenheng mellom overflødig vekt hos mennesker og sammensetningen av den mikrobielle befolkningen i tarmene. Et dusin fete mennesker som ble enige om å sette sine bellies på vitenskapsaltet, ble delt inn i to grupper. Man gikk på en fettfattig diett, den andre en lav-karbo diett. Alle frivillige mistet vekten, og samtidig forandret de forholdet mellom de to hovedgruppene av intestinale mikroorganismer: Antall Firmicutes-celler gikk ned, og antallet Bacteroidet tvert imot vokste. På et fettfattig kosthold ble en slik forandring merkbar senere - etter at pasientene mistet 6% av sin vekt og på lavt karboendiet - etter å ha mistet de første kiloene (2% av den opprinnelige kroppsvekten). I dette tilfellet var endringen i sammensetningen av mikrofloraen jo mer uttalt, jo mindre ble deltakerens vekt i eksperimentet.

Bekjempe fedme

Resultatene av den videre studien av forskere om endringer i den symbiotiske musemikrobielle organismen (se boksen "Testet på mus") bekreftet briljant hypotesen om at mikrobiotene til overvektige individer bidrar til dypere behandling av mat. Sammenligning av avføring DNA-prøver fra overvektige og normale mus har vist at fedme mikrobiomer er mettet med enzymgener som muliggjør mer effektiv nedbrytning av polysakkarider. Tarmene av fete mus inneholdt store mengder sluttprodukter av gjæring - forbindelser av eddiksyre og smørsyre, noe som indikerer en dypere behandling av matkomponenter. Kalorimetrisk (fra ordet "kalorier"!) Analyse av muskasseprøver bekreftet dette: Avkjøling av ob / ob-mus inneholdt færre kalorier enn villtype mus som ikke absorberte energi helt fra mat.

I tillegg til den viktige informasjonen om den "mikrobielle" komponenten av fedme, kunne forfatterne vise den grunnleggende likheten til mikroflora hos obese mennesker og mus, noe som åpner nye perspektiver i studiet av problemet med overvekt, og muligens løsningen av dette problemet ved å "transplantere" sunn mikroflora eller dens dannelse hos pasienter vektige.

Testet på mus

Og med utmattelse

Det faktum at mikrobioten kan kontrollere vertenes metabolisme er ikke lenger i tvil. Forskningslaboratorium Gordon, viet til problemet med overvekt, fikk lov til å kaste en bro til behandling av metabolske sykdommer. Blant dem er slike typer generell utmattelse som påvirker barn fra ett til fire år i fattige land med et tropisk klima, som marasmus (dette ordet har bare et språklig forhold til marasmus: gresk marasmoz betyr bokstavelig talt utmattelse, utryddelse) og kwashiorkor (på språket til en av stammene Ghana kwashiorkor - "rød gutt"). Fremveksten av sykdommer er forbundet med mangel på proteiner og vitaminer under overgangen fra amming til voksen mat. Men sykdommer selektivt påvirker barn hvis brødre og søstre ikke opplevde noen problemer med overgangen til det tradisjonelle dietten for regionen. Studier har vist at den tarmmikroflora av syke barn er svært forskjellig fra foreldrenes mikroflora, samt fra mikrofloraen til friske brødre og søstre. Først og fremst ble det observert det nesten fullstendige fraværet i tarmpopulasjonen av bakteroidetene og dominansen av sjeldne arter som tilhører typene Proteobacteria og Fusobacteria. Etter de syke barna (forsiktig, for ikke å overdose!) Fødte intensivt protein mat, så mikrobiota som en vanlig, som i slektninger, med forekomsten av Bactrotetes og Firmicutes.

Nylige studier har ikke bare fundamentalt endret den nåværende forståelsen av den menneskelige intestinale mikrofloraen, men bidro også til fremveksten av et konsept som betrakter tarmmikrobiota som et ekstra multicellulært menneskelig "organ". Et organ bestående av forskjellige cellelinjer som er i stand til å kommunisere både mellom seg selv og med vertsorganismen. Kroppen som omfordeler energistrømmer, utfører viktige fysiologiske reaksjoner, endringer som påvirkes av miljøet og selvregenererer når forandringer er forårsaket av ytre forhold. Fortsatt studien av "bakterieorganet" kan og burde føre til forståelse av lovene for dets funksjon, avsløring av sine subtile forbindelser med vertsorganismen og som et resultat fremkomsten av nye metoder for bekjempelse av menneskers sykdommer gjennom målrettet behandling av dysfunksjoner av begge komponentene i metaorganismen.

16-årig analyse

Ribosomale ribonukleinsyrer (rRNA) er flere RNA-molekyler som danner basis for ribosomet. Hovedfunksjonen til rRNA er å gjennomføre oversettelsesprosessen - lese informasjon fra mRNA ved hjelp av tRNA-adaptermolekyler og katalysere dannelsen av peptidbindinger mellom aminosyrer knyttet til tRNA.

innhold

Ribosomale subpartikler og rRNA-nomenklatur

På elektronmikroskopiske bilder av intakte ribosomer er det merkbart at de består av to subpartikler med forskjellige størrelser.

Masseforholdet mellom delpartiklene er

2: 1; massene uttrykkes igjen i direkte målte sedimenteringskonstanter (sedimenteringshastighet i Svedberg-enheter, S) under ultracentrifugering, det er denne parameteren som danner grunnlaget for rRNA-nomenklaturen og ribosomer og ribosomale subpartikler: typebetegnelsene er brukt

For eksempel er det ribosomale RNA av prokaryoter med en sedimenteringskoeffisient på 16 Svedberg-enheter betegnet som 16S rRNA.

Siden sedimentasjonskoeffisientene avhenger ikke bare av molekylvekten, men også på partikkelsens form, er sedimentasjonskoeffisientene under dissosiasjon ikke-additiv: for eksempel bakterielle ribosomer med en molekylær masse

3 * 10 6 Dalton har en sedimenteringskoeffisient på 70S, betegnet som 70S og dissoserer til underenheter 50S og 30S:

Ribosomale underenheter inneholder hver en lang lengde rRNA molekyl, hvis masse er

1/2 - 2/3 av massen av den ribosomale delpartikkelen, således, når det gjelder bakterielle 70S ribosomer, inneholder 50S-underenheten 23S rRNA (lengde

3000 nukleotider) og 30S-underenheten inneholder 16S rRNA (lengde

1500 nukleotider); I tillegg til den "lange" rRNA inneholder den store ribosomale underenheten også ett eller to "korte" rRNAer (5S rRNA av bakterielle ribosomale underenheter 50S eller 5S og 5,8S rRNA av de større ribosomale underenheter av eukaryoter).

syntese

Ribosomal RNA utgjør en stor andel (opptil 80%) av totalt cellulært RNA; en slik mengde rRNA krever intens transkripsjon av dets kodende gener. Denne intensiteten er gitt av et stort antall kopier av gener som koder for rRNA: i eukaryoter er det fra flere hundre (

200 i gjær) til titusener (for forskjellige linjer bomull ble det rapportert 50-120 000 eksemplarer) av gener organisert i arrays av tandem repeats.

I mennesker er generene som koder for rRNA, også organisert i grupper av tandem-gjentagelser plassert i de sentrale områdene av den korte armen av kromosom 13, 14, 15, 21 og 22.

De syntetiseres av RNA-polymerase I som et langt molekyl av pre-ribosomalt RNA, som kuttes i separate RNA som danner basis for ribosomet. I bakterier og archaea inkluderer det opprinnelige transkriptet vanligvis 16S, 23S og 5S rRNA, mellom hvilke pre-rRNA-sekvensene er slettet. Vanligvis er mellom 16S og 23S rRNA-genene et eller flere tRNA-gener; så i E. coli har det første transkripsjonen av en slik gruppe gener følgende sekvens:

(16S rRNA) - (1-2 tRNA) - (23S rRNA) - (5S rRNA) - (0-2 tRNA)

Et slikt transkript spaltes i fragmenter av pre-rRNA og tRNA av enzymet ribonuklease III.

I eukaryoter blir 18S, 5,8S og 25/28 rRNA transkribert med RNA-polymerase I, mens 5S-rRNA-genet transkriberes med RNA-polymerase III.

I eukaryoter er stedene for konsentrasjon av gener som koder for rRNA, vanligvis godt synlige i cellekjernen, på grunn av akkumulering av ribosomunderenheter rundt dem, som umiddelbart settes sammen. Disse klyngene er godt fargede med cytologiske fargestoffer og er kjent som nukleolus. Følgelig er nærværet av nukleoli karakteristisk ikke for alle faser av cellesyklusen: under celledeling i profasen dissocierer nukleoluset siden rRNA-syntese suspenderes og omformes på slutten av telofasen når rRNA-syntese gjenopptas.

Sammenligning av pro og eukaryotisk rRNA

Ribosomal RNA (som ribosomene) av prokaryoter og eukaryoter er forskjellige fra hverandre, selv om de viser signifikant likhet mellom regionene i sekvensene. 70S prokaryotisk ribosom består av en stor 50S underenhet (bygget på grunnlag av to rRNA molekyler - 5S og 23S) og en liten 30S underenhet (bygget på grunnlag av 16S rRNA). 80S eukaryotisk ribosom består av en stor 60S underenhet (bygget på grunnlag av tre rRNA molekyler - 5S, 5,8S og 28S) og en liten 40S underenhet (bygget på grunnlag av 18S rRNA).

Bruk sekvensinformasjon

Informasjon om rRNA av en bestemt organisme brukes i medisin og evolusjonær biologi.

  • RRNA-genet er et av de mest konservative (minst variable) gener. Derfor kan den systematiske posisjonen til organismen og tidspunktet for divergensen med lukkede arter bestemmes på grunnlag av en analyse av likheter og forskjeller i rRNA-sekvenser.
  • rRNA er et mål for et stort antall antibiotika, hvorav noen brukes i klinisk praksis, både for å undertrykke veksten av bakterier (antibiotika som binder til det prokaryote ribosomet) og til behandling av menneskelige sykdommer (antibiotika som binder til det eukaryote ribosomet). Den første gruppen inkluderer kloramfenikol, erytromycin, kasugamycin, mikrocoxin, spektinomycin, streptomycin, tiostrepton. Til den andre hygromycin B, paromomycin.

Relaterte Artikler Hepatitt